O echipă de chimişti de la MIT a inventat o tehnică nouă de etichetare a proteinelor, care permite o vizualizare de înaltă rezoluţie a moleculelor din interiorul celulelor. Eticheta folosită este un echivalent pentru microscopia electronică al proteinei verzi fluorescente.
Molecula verde luminoasă cunoscută sub numele de proteina verde fluorescentă (GFP) a revoluţionat biologia moleculară. Când GFP este ataşată de o anumită proteină în interiorul unei celule, oamenii de ştiinţă o pot identifica şi localiza cu uşurinţă folosind microscopia fluorescentă. Totuşi, GFP nu poate fi folosită cu microscopia electronică, ce oferă o rezoluţie mult mai mare decât microscopia fluorescentă.
Chimişti de la MIT au conceput un echivalent al GFP pentru microscopia electronică – o etichetă ce permite oamenilor de ştiinţă să marcheze şi să vizualizeze proteine cu o claritate fără precedent.
“Nu se pot distinge trăsăturile interne ale lucrurilor care apar de doar câţiva pixeli prin microscopie fluorescentă – spre exemplu, o mitocondrie. Dar cu ajutorul microscopului electronic este foarte uşor să distingi structurile interne cele mai complicate”, spune Jeff Martell, masterand în chimie la MIT şi autor principal al lucrării care descrie noua tehnică, lucrare publicată în numărul din 21 octombrie al ediţiei online a Nature Biotechnology.
Noua etichetă ar putea ajuta oamenii de ştiinţă să localizeze multe proteine celulare, aducând astfel noi informaţii despre funcţiile acestor proteine, conform cercetătorilor.
Îmbunătăţiri aduse naturii
Numită şi APEX, noua etichetă este similară cu unele proteine naturale care au fost testate ca etichete în microscopia electronică. Peroxidaza din hrean (HRP) este o etichetă folosită frecvent, dar funcţionează doar în anumite compartimente ale unei celule. Alte etichete descoperite recent funcţionează în întreaga celulă, dar sunt greu de folosit deoarece implică expunerea probei la lumină şi barbotarea oxigenului în aceasta.
Pentru a îmbunătăţi aceste metode, cercetătorii au pornit de la o proteină asemănătoare cu HRP, numită ascorbat peroxidază (APX). APX este mai versatilă decât HRP, deoarece poate funcţiona în citosolul unei celule, în principala cavitate a acesteia.
Atât HRP, cât şi APX aparţin unei clase de enzime numite peroxidaze, care primesc un electron şi un proton din alte molecule printr-un proces numit oxidare. Fiecare peroxidază are ţinte diferite, iar una din principalele ţinte ale HRP este o moleculă numită DAB, care la oxidare poate fi observată la microscopul electronic. Cercetătorii au modificat genetic APX astfel încât şi aceasta să ţintească DAB.
Pentru a folosi această nouă etichetă numită APEX (APX prelucrat - "engineered APX"), cercetătorii introduc într-o celulă vie un mic inel de ADN conţinând gena pentru APEX ataşată genei pentru proteina pe care doresc să o vizualizeze. Astfel, celula va produce proteina, legată de APEX.
Această imagine realizată cu un microscop electronic înfăţişează o mitocondrie al cărei matrix a fost impregnat cu APEX, făcându-l să apară întunecat. Proeminenţele mai luminoase din cadrul matrixului reprezintă spaţiul intermembranar.
credit imagine: Tom Deerinck şi Jeff Martell
În continuare, cercetătorii trebuie să introducă DAB, care nu este găsită în mod normal în celule. Acest pas are loc în timpul procesului de fixare, sau de stabilizare a celulei, care trebuie făcut înainte ca celula să poată fi observata la microscopul electronic.
Când proteina APEX oxidează DAB, aceasta generează radicali ce se transformă rapid într-un polimer similar gudronului. Acest polimer poate fi detectat la microscopul electronic, permiţând cercetătorilor să localizeze proteina ţintă.
O problemă biologică rezolvată
Pentru a demonstra utilitatea noii lor etichete, cercetătorii au încercat să rezolve o problemă privind locaţia unei proteine transportatoare de calciu descoperită anul trecut. Două grupe de cercetare au identificat proteina şi au descoperit că aceasta se află în interiorul mitocondriei, dar au avut teorii contradictorii privind locaţia exactă şi orientarea proteinei. Folosind noua tehnică de vizualizare, echipa condusă de MIT a etichetat proteina şi a stabilit că aceasta este ataşată de membrana internă a mitocondriei, în contact cu matrixul mitocondrial.
De asemenea, echipa a arătat că noua etichetă poate marca proteine în întreaga celulă, nu doar în interiorul mitocondriei, ci şi în nucleu, reticul endoplasmatic şi citosol.
Martell şi Alice Ting, profesoară asociată de chimie Ellen Swallow Richards la MIT şi autor senior al lucrării publicate în Nature Biotechnology, au inventat această nouă tehnologie. Alţi autori care au ajutat la testarea etichetei şi explorarea aplicaţiilor sunt Mark Ellisman, Thomas Deerinck şi Gina Sosinsky de la University of California at San Diego, Yasemin Sancak şi Vamsi Mootha de la Harvard Medical School şi Thomas Poulos de la University of California at Irvine.
În studiile curente, cercetătorii lucrează la umplerea unor celule întregi, precum neuronii, cu acest agent. Asta ar face ca anumiţi neuroni dintr-o imagine la microscopul electronic să iasă în evidenţă, facilitând astfel identificarea conexiunilor pe care aceştia le fac cu alţi neuroni. În acest scop, cercetătorii de la MIT colaborează cu Joshua Sanes, profesor de biologie moleculară şi celulară la Harvard University, care spune că, în opinia lui, noua tehnică de etichetare va fi foarte folositoare.
“Vrem să aflăm exact ce conexiuni fac aceste celule, iar APEX este o metodă bună de etichetare a celulelor pentru microscopia electronică. Putem eticheta anumite tipuri de celule şi descoperi rolul lor în circuitul neuronal”, spune Sanes.
Ting şi Martell au depus o cerere de brevetare a noii lor tehnologii şi lucrează acum la transformarea APEX într-o moleculă mai stabilă şi mai capabilă de a fixa hemul (un atom de fer înglobat într-un compus organic), lucru necesar pentru funcţionarea sa optimă.
Cercetarea a fost finanţată de National Institutes of Health.
Traducere realizată de Diana Anastase după A new glow for electron microscopy.
