Episodul 1. Descoperirea proteinei fluorescente verzi
În 1955 Osamu Shomomura era asistentul profesorului Yashimasa la Universitatea Nagoya. Shomomura a primit ca sarcină de la profesor să descopere care este cauza strălucirii resturilor unei moluşte, Cypridina, atunci când sunt amestecate cu apă. În 1956, întrecând aşteptările, căci Shomomura era atunci doar un asistent neexperimentat, iar cercetările făcute deja de un grup american pe aceeaşi temă au eşuat, a descoperit proteina ce strălucea în molusca Cypridina. Imediat după publicarea rezultatelor cercetărilor, Shomomura a fost recrutat de Universitatea din Princeton, New Jersey şi a primit titlul de doctor de la Univesitatea Nagoya.
Ulterior Shimomura a început să studieze alte lucruri luminiscente în mod natural, printre care şi meduza Aequorea victoria, ale cărei extremităţi, atunci când este agitată, emit o lumină verde.
Dacă nu aţi citit prima parte a articolului, daţi clic AICI.
Aequorea victoria
În toamna lui 1961 Shimomura şi Frank Johnson, cel care îl recrutase pentru Princeton, au adunat meduze pentru a strânge material fluorescent. Din 10000 de meduze au reuşit să obţină câteva miligrame de proteină, pe care au numit-o aequorină. Shimomura observase întâmplător că atunci când făina obţinută din extremităţile meduzei intra în contact cu apa de mare, emitea o lumină albastră. Ionii de calciu ai apei de mare erau cei „vinovaţi” pentru reacţia chimică ce se concretizează în lumina albastră.
În 1962, la publicarea rezultatelor lor privind obţinerea aequorinei, cei doi au menţionat şi faptul că au reuşit să izoleze o proteină care reflecta o lumină verde în lumina soarelui, galben la lumina becului şi un verde fluorescent în lumina ultravioletă. Era pentru prima oară când cineva descria proteina fluorescentă verde. În 1970 Shimomura a arătat că PFV conţinea un cromofor special (cromoforul este o grupare de atomi care absoarbe şi emite lumină). Când este bombardat cu ultraviolete, cromoforul primeşte energie şi este excitat. În meduză, cromoforul transformă lumina albastră a aequorinei în lumină verde. Aceasta este cauza pentru care meduza şi aequorina strălucesc în mod diferit.
Episodul 2. Proteina fluorescentă verde ca marker al activităţilor celulare
Înainte însă de a detalia ideea pentru care Martin Chalfie a primit premiul Nobel, căci despre acest lucru vorbim în aceste paragrafe, câteva amănunte despre biologia celulei, pentru o mai bună înţelegere a meritului lui Chalfie şi a descoperirii sale.
Proteinele, câteva mii în organismul uman, execută mai toate activităţile din interiorul celulei. Deşi au multe funcţii, ele sunt construite în acelaşi mod, din 20 de aminoacizi legaţi împreună, singura diferenţa dintre o proteină şi alta constând în lungimea lanţului, ordinea aminoacizilor şi modul în care este „împăturit” lanţul de aminoacizi.
În genere, fiecare genă conţine „reţeta” pentru o proteină. Atunci când o proteină este necesară unui celule, gena respectivă este activată, iar rezultatul este producerea proteinei. De exemplu, atunci când nivelul de zahăr în sânge este prea mare, gena insulinei din celulele beta ale pancreasului este activată. Toate celulele din corpul uman au gena insulinei în nucleu, dar numai celulele beta ale pancreasului reacţionează la nivelul crescut al zahărului din sânge. Odată activată, gena începe procesul de copiere; copia genei insulinei este apoi transferată din nucleu în citoplasmă, atelierul de lucru al celulei, unde aminoacizii sunt puşi laolaltă, conform instrucţiunilor, pentru a crea o proteină.
Ideea lui Chalfie a fost aceea de a conecta gena proteinei fluorescente verzi cu activatorii altor gene ori cu genele altor proteine în scopul: a. observării activării a diferite gene şi b. observării producerii a diferite proteine. Lumina verde funcţionează pe post de marker al activităţii intracelulare. Dar pentru a-şi aplica ideea, Chalfie trebuia să localizeze întâi gena proteinei fluorescente verzi. Norocul lui Chalfie a fost că un alt cercetător, Douglas Prasher deja începuse „vânătoarea” acestei gene, iar în doi ani de la momentul în care cei doi savanţi au intrat în contact, Prasher a identificat şi trimis gena către Chalfie. Gena a fost introdusă, pentru studiu, într-o bacterie intestinală folosită asiduu pentru cercetări, Escherichia Coli. Astfel, prin inserţia proteinei fluorescente verzi, bacteria a fost făcută să radieze lumină verde în lumina ultravioletă.
Pasul următor a fost acela de a introduce PFV în receptorii tactili ai viermelui Caenorhabditis elegans. Rezultatele acestui experiment au fost publicate în revista Science în februarie 1994.
Inserţia unei gene a proteinei fluorescente verzi în C.elegans
Episodul 3. Introducerea proteinelor multicolore
Contribuţia lui Roger Tsie este aceea că a reuşit să extindă paleta de culori disponibilă cercetătorilor şi să intensifice culorile emise de proteine. Tsien a observat că cromoforul PFV este format din 238 de aminoacizi, iar trei aminoacizi din poziţiile 65-67 interacţionează unul cu celălalt pentru a forma cromoforul. Tsien a arătat că această interacţiune necesită oxigen şi a explicat modul în care aceasta poate avea loc fără prezenţa altor proteine. Cu ajutorul tehnologiilor ADN, Tsien a schimbat diferiţi aminoacizi în diferite părţi ai proteinei fluorescente verzi, ceea ce a dus la moduri diferite de absorbţie şi emisie a luminii, fenomen concretizat în culori diferite ale proteinei. Ce nu a reuşit în prima instanţă Tsien a fost să facă proteină să emită culoarea roşie. Dar doi cercetători ruşi, Mikhail Matz şi Sergei Lukyanov au găsit, în coralii fluorescenţi, şase proteine asemănătoare PFV, dintre care una emitea culoarea roşie. Numai că aceasta era mai mare şi mai grea şi era formată din 4 lanţuri de aminoacizi, iar nu din unul cum era PFV. Tsien a rezolvat această problemă „reproiectând” proteina, făcând-o stabilă şi uşor de conectat la alte proteine.
Aşadar, la 46 de ani de la descoperirea proteinei fluorescente verzi de către Shimomura, există un întreg „arsenal” de proteine emiţând diferite culori puse la dispoziţia cercetătorilor pentru a determina evenimentele intracelulare.
Articolul este inspirat de materiale de pe siteul nobelprize.org
