Escavaţii în situl Sima de los Huesos, Spania, unde au fost descoperite mai mult de 5.500 de oase ale unor hominizi din pleistocenul mediu.

În a doua parte a articolului dedicat prezentării unor noi metode de analiză a ADN-ului, vorbim despre instrumente de secvenţiere a ADN-ului străvechi. Prima regulă a paleogeneticii este următoarea:cu cât mostra este mai veche, cu atât mai fragmentat este ADN-ul.



Prima parte a articolului poate fi citită aici

Nucleazele (grup de enzime care catalizează scindarea acizilor nucleici în oligonucletide şi monunucletide) exogene şi endogene trec la treabă imediat după instalarea morţii organismului, degradând ţesuturile şi materialul genetic. Apa şi oxigenul au, de asemenea, influenţă, afectând materialul genetic.



ADN-ul are o perioadă de înjumătăţire de circa 521 de ani în oase, asta însemnând că cele mai fosilizate mostre conţin doar puţin material genetic endogen. Nu e nicio mirare că studiile iniţiale au dus la identificări greşite.

Prima problemă a fost generată de faptul că tehnicile de clonare din anii '80 se bazau pe enzime pentru a repara ADN-ul, dar operaţiunea nu se termina mereu cu succes, apărând erori în procesul de secvenţiere. Introducerea reacţiei în lanţ a polimerazei - PCR (eng. polymerase chain reaction) a evitat această problemă prin eliminarea nevoii de a clona mostre de ADN înainte de secvenţiere; dar în mod obişnuit PCR doar amplifică fragmentele de ADN care conţin mai mult de 90 de baze azotate. Prin urmare, este posibil ca PCR să ducă la amplificarea ADN-ului modern contaminator, prezent în ADN-ul străvechi. Este extrem de dificil şi consumator de timp să asamblezi un genom întreg utilizând reacţia în lanţ a polimerazei clasice, pentru că metoda amplifică doar câte un fir de ADN la un moment dat.

Dar a apărut o nouă generaţie în materie de secvenţiere. Tehnologia, intrată în uz la mijlocul anilor 2000, foloseşte tehnici mai simple şi mai rapide de pregătire a ADN-ului pentru secvenţierea paralelă, permiţând astfel cercetătorilor să citească toate moleculele ADN dintr-o anumită mostră. "Recuperezi toată informaţia genetică", spune Matthias Meyer, cercetător la Institutul Max Planck pentru Antropologie Evoluţionistă, Germania, care a fost un pionier al recentelor progrese metodologice cu privire la secvenţierea ADN-ului străvechi. "De la aceeaşi cantitate de extract de ADN poţi obţine de mii sau de sute de mii de ori mai multă informaţie. Acest fapt a făcut posibilă secvenţierea ADN-ului străvechi la scară largă".

A doua generaţie de secvenţiere este utilă în special pentru analiza ADN-ului foarte fragmentat, întrucât poate asigura analiza secvenţelor foarte scurte de necleotide. Capacitatea de a gestiona 30 ori 35 de baze este nepreţuită.

Progresele în ce priveşte procesarea materialului genetic străvechi înainte de secvenţiere i-au ajutat, de asemenea, pe cercetători, care se străduiesc să analizeze fragmente de ADN mai vechi şi, deci, mai scurte. În oasele străvechi ADN-ul este amestecat printre diverse molecule organice şi anorganice, incluzând colagenul şi forma minerală de calciu denumită hidroxiapatită, care trebuie dizolvată pentru a fi posibilă extragerea secvenţelor de material genetic. "Provocarea în extragerea ADN-ului este de a-l purifica, de a înlătura substanţele care pot interfera cu analiza", afirmă Meyer. În laboratorul acestuia se utilizează un buffer de extracţie pentru a rezolva această problemă, folosind acidul etilendiaminotetraacetic (EDTA) pentru a dizolva hidroxiapatita şi proteinaza K (o enzimă) pentru a dizolva colagenul.

Laboratorul lui Meyer a optimizat, de asemenea, formula de a uni bufferele cu isopropanol, care ajută în captarea fragmentelor foarte scurte de ADN, şi clorhidrat de guanidină (care ajută la ataşarea ADN-ului de filtre de siliciu speciale aflate în tuburile centrifugale).

În cadrul unui articol publicat în anul 2012 în revista Nature, Meyer şi colatoratorii săi au etalat rezultatele excelente obţinute în secvenţierea genomului unui om de denosivan (ADN-ul a fost extras dintr-un deget,singura parte a scheletului descoperită), o rudă dispărută a omului de neanderthal, recoltând, secvenţiind şi punând laolaltă fragmente de ADN, unele, mai mici de 35 de baze azotate. Osul este estimat la 30-80.000 de ani; fiind vorba de doar un deget, nu există suficient carbon pentru datarea mai precisă.

În plus faţă de progresele în materie de extracţie şi izolare a ADN-ului, Meyer şi colegii săi au reuşit şi altceva: utilizarea unei librării constând într-o singură catenă de ADN - pentru pregătirea ADN-ului pentru secvenţiere. În loc să folosească ADN complet pentru a crea librăriile genetice ce pot fi introduse în secvenţiator, cum era practica standard, Meyer a separat spirala dublă, apoi a pregătit librăria de secvenţe de ADN folosind o singură catenă, dublând cantitatea de fragmente pentru secvenţiere. Această metodă a ajutat şi la evitarea unei etape de purificare care ducea la pierderea unei părţi a materialului genetic din mostră - în acest fel sporind numărul de fragmente ADN ce pot fi recuperate de la specimene degradate ori de mici dimensiuni. Această tehnică a permis obţinerea unei rezoluţii fără precedent.

Capacitatea de obţinere a unor fragmente foarte mici de ADN nu schimbă faptul că orice mostră nu va conţine secvenţe genetice doar de la organismul de interes. Cu toate procedurile adoptate pentru evitarea contaminării, fragmente de ADN modern (de la om, plante, microbi ori alte organisme) sunt mai numeroase decât bucăţile de ADN vechi de sute ori mii de ani. Pentru a rezolva această problemă, cercetătorii au inventat metode de analiză inteligente care le permit diferenţierea dintre secvenţele vechi şi cele moderne, pe baza unor tipare specifice ale modificării moleculare la care este supus ADN-ul.

Unul dintre aceste tipare se referă la diaminarea citozinei, proces în care citozina (una dintre cele patru baze azotate care formează ADN-ul) este înlocuită cu uracilul (o bază care în mod normal apare în ARN). Cercetătorii au descoperit o corelaţie clară între vârsta mostrei biologice (raportată la data decesului), condiţiile de păstrare în care a fost găsită mostra şi rata deaminării citozinei. Aceste modele ale diaminării citozinei îi poate ajuta pe cercetătorii interesaţi în analiza ADN-ului străvechi să distingă între ADN-ul uman modern şi cel al unui om de neanderthal, de exemplu, care sunt foarte asemănătoare sub aspect genetic.

Partea a treia a articolului

Traducere după What's old is new again cu acordul editorului.